Un microscopio recientemente desarrollado proporciona a los científicos una herramienta muy mejorada para estudiar cómo los trastornos neurológicos como la epilepsia y la enfermedad de Alzheimer afectan la comunicación neuronal. El microscopio está optimizado para realizar estudios utilizando técnicas optogenéticas, una tecnología relativamente nueva que utiliza la luz para controlar y generar imágenes de neuronas modificadas genéticamente con proteínas sensibles a la luz.
«Nuestro nuevo microscopio se puede usar para explorar los efectos de diferentes mutaciones genéticas en la función neuronal», dijo Adam Cohen de la Universidad de Harvard, EE. UU., y líder del equipo de investigación que desarrolló el microscopio. «Algún día podría usarse para probar los efectos de los fármacos candidatos en las neuronas derivadas de personas con trastornos del sistema nervioso para tratar de identificar medicamentos para tratar enfermedades que no tienen tratamientos adecuados en este momento».
El nuevo microscopio, llamado Firefly, puede obtener imágenes de un área de 6 milímetros de diámetro, más de cien veces más grande que el campo de visión de la mayoría de los microscopios utilizados para optogenética. En lugar de estudiar la actividad eléctrica de una neurona, la gran área de imágenes hace posible activar los pulsos eléctricos que usan las neuronas para comunicarse y luego ver esos pulsos viajar de una célula a otra a través de un gran circuito neuronal que contiene cientos de células. En el cerebro, cada neurona generalmente se conecta a otras mil neuronas, por lo que es importante ver la red más grande para comprender cómo las enfermedades neurológicas afectan la comunicación neuronal.
En la revista The Optical Society (OSA) Expreso de óptica biomédica, Cohen y sus colegas informan cómo ensamblaron el nuevo microscopio por menos de $ 100,000 utilizando componentes que casi todos están disponibles comercialmente. El microscopio no solo toma imágenes de un área grande, sino que también recoge la luz de manera extremadamente eficiente. Esto proporciona la alta calidad de imagen y la alta velocidad necesarias para observar pulsos eléctricos neuronales que duran cada uno solo una milésima de segundo.
Usando la luz para ver el fuego de las neuronas
El nuevo microscopio es ideal para estudiar neuronas humanas cultivadas en el laboratorio. En la última década, los científicos han desarrollado modelos de células humanas para muchos trastornos del sistema nervioso. Estas células se pueden modificar genéticamente para que contengan proteínas sensibles a la luz que permitan a los científicos usar la luz para hacer que las neuronas se disparen o para controlar variables como los niveles de neurotransmisores o la agregación de proteínas. Otras proteínas fluorescentes sensibles a la luz convierten los pulsos eléctricos invisibles que provienen de las neuronas en breves destellos de fluorescencia que se pueden visualizar y medir.
Estas técnicas han hecho posible que los científicos estudien la entrada y la salida de neuronas individuales, pero los microscopios disponibles en el mercado no están optimizados para aprovechar al máximo el potencial de los enfoques optogenéticos. Para llenar este vacío tecnológico, los investigadores diseñaron el microscopio Firefly para estimular las neuronas con un patrón complejo que contiene un millón de puntos de luz y luego registrar los breves destellos de luz fluorescente que corresponden a los pulsos eléctricos disparados por las neuronas.
Cada píxel del patrón de luz puede estimular de forma independiente una proteína sensible a la luz. Debido a que los píxeles pueden tener muchos colores distintos, se pueden activar diferentes tipos de proteínas sensibles a la luz a la vez. El patrón de luz se puede programar para cubrir una neurona completa, estimular ciertas áreas de una neurona o usarse para iluminar varias células a la vez.
«Este sistema óptico proporciona un millón de entradas y un millón de salidas, lo que nos permite ver todo lo que sucede en estos cultivos neuronales», explicó Cohen.
Después de estimular las neuronas, el microscopio usa una cámara de imágenes a mil fotogramas por segundo para capturar la fluorescencia inducida por los pulsos eléctricos extremadamente cortos. «El sistema óptico debe ser muy eficiente para detectar buenas señales en un milisegundo», dijo Cohen. «Se invirtió una gran cantidad de ingeniería en el desarrollo de ópticas que no solo pueden generar imágenes de un área grande, sino que también lo hacen con una eficiencia de recolección de luz muy alta».
Para recolectar luz de manera eficiente en un área grande, el microscopio Firefly usa una lente objetivo del tamaño de una lata de refresco en lugar de la lente objetivo del tamaño de un pulgar que usan la mayoría de los microscopios. Los investigadores también utilizaron una configuración óptica que aumenta la cantidad de luz que estimula las neuronas para ayudar a garantizar que las neuronas emitan una fluorescencia brillante cuando se activan.
«El único elemento personalizado en el microscopio es un pequeño prisma colocado entre las neuronas y la lente del objetivo», explicó Cohen. «Este importante componente hace que la luz viaje a lo largo del mismo plano que las células en lugar de entrar en la muestra de forma perpendicular. Esto evita que la luz ilumine el material que se encuentra por encima y por debajo de las células, lo que reduce la fluorescencia de fondo que dificultaría ver la fluorescencia que realmente proviene de las neuronas».
Observando 85 neuronas a la vez
Los investigadores demostraron su nuevo microscopio usándolo para estimular ópticamente y registrar la fluorescencia de neuronas humanas cultivadas. «Las neuronas eran un gran lío de espaguetis enredados», dijo Cohen. «Demostramos que era posible resolver 85 neuronas individuales al mismo tiempo en una medición que tomó alrededor de 30 segundos».
Después de la estimulación inicial y las imágenes, los investigadores pudieron encontrar 79 de esas 85 células por segunda vez. Esta capacidad es importante para los estudios que requieren que se tomen imágenes de cada célula antes y después de la exposición a un fármaco, por ejemplo.
En una segunda demostración, los investigadores usaron el microscopio para mapear las ondas eléctricas que se propagan a través de células cardíacas cultivadas. Esto demostró que el microscopio podría usarse para estudiar ritmos cardíacos anormales, que ocurren cuando las señales eléctricas que coordinan los latidos del corazón no funcionan correctamente.
«El sistema que desarrollamos está diseñado para observar una muestra relativamente plana, como las células cultivadas», dijo Cohen. «Ahora estamos desarrollando un sistema para realizar enfoques optogenéticos en tejido intacto, lo que nos permitiría observar cómo se comportan estas neuronas en su contexto nativo».
Los investigadores también iniciaron una empresa de biotecnología llamada Q-State Biosciences que utiliza una versión mejorada del microscopio para trabajar con empresas farmacéuticas en el descubrimiento de fármacos.
