La herramienta de edición del genoma conocida como CRISPR/Cas9 ha abierto muchas puertas para la investigación biomédica al permitir que los científicos editen con precisión las secuencias de ADN y alteren la función. La tecnología ofrece esperanza para corregir defectos genéticos y prevenir enfermedades.
Los científicos despliegan etiquetas fluorescentes brillantes para ayudarlos a visualizar la ubicación precisa de una proteína de interés mediante la edición de genes. Investigadores del Instituto Allen para la Ciencia Celular en Seattle, WA, han desarrollado un método basado en CRISPR para etiquetar con mayor precisión los genes que codifican proteínas importantes mejor que antes. El equipo está construyendo una biblioteca de líneas de células madre que etiqueta 10 genes importantes vinculados a estructuras celulares clave y pondrá estos cultivos a disposición de la comunidad investigadora.
Ruwanthi Gunawardane, Brock Roberts y Amanda Haupt, y sus colegas del Allen Institute for Cell Science, son los autores del artículo «Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization», publicado el 15 de octubre de 2017. en Biología molecular de la célula, una revista de la Sociedad Americana de Biología Celular.
Esta nueva estrategia de etiquetado y detección tiene muy poco margen de error y evita la «cicatriz» en el código genético creada por otros métodos de etiquetado, que pueden producir efectos no deseados en la regulación de genes, dicen los investigadores. La biblioteca de células madre etiquetadas que se está construyendo representa el comienzo de lo que los investigadores esperan que sea una colección mucho más grande de líneas celulares con etiquetas en proteínas específicas estudiadas extensamente por biólogos celulares. La intención es que estas líneas de células madre sirvan como pantallas genéticas y farmacológicas, y como modelos para enfermedades a medida que las células se diferencian.
Para ver más de cerca cómo se creó esta biblioteca de células madre, lea las siguientes preguntas y respuestas con respuestas proporcionadas por Gunawardane (RG) y Roberts (BR):
¿Cuáles son los principales beneficios y desventajas del marcado de genes endógenos?
RG: El marcado de genes endógenos, a diferencia de otros métodos, introduce la etiqueta próxima al gen de interés en sus loci genómicos. Esto da como resultado la expresión de la fusión etiquetada a niveles fisiológicos, ya que está regulada por su promotor nativo y permite estudiar la localización y la dinámica de la proteína y la estructura en condiciones «normales». Los métodos de sobreexpresión tradicionales, como las transfecciones transitorias con plásmidos o la transducción vírica, pueden introducir muchos efectos no deseados, como la mala ubicación y/o la citotoxicidad. A diferencia de los sistemas de sobreexpresión, el etiquetado endógeno también da como resultado un fondo de fluorescencia reducido y artefactos de localización errónea y produce imágenes excepcionales. El inconveniente del marcado endógeno es que es ineficiente y, a menudo, puede ser impreciso, pero ambos problemas se pueden abordar como se analiza a continuación.
¿En qué se diferencia/mejor el etiquetado mediado por HDR?
BR: HDR (reparación dirigida por homología) es el mecanismo de reparación de la célula que da como resultado la incorporación de una secuencia extraña en el ADN genómico (como se hace aquí con GFP). Por lo tanto, HDR permite incorporar una etiqueta con precisión en un locus/gen objetivo para producir una proteína de fusión endógena. Otros métodos de introducción de una secuencia de etiqueta dejan una «cicatriz» que puede provocar efectos no deseados en la regulación de genes, por ejemplo.
¿Qué hace que su protocolo de etiquetado mediado por CRISPR/Cas9 sea especial, único y novedoso?
RG: Usamos un método de proteína ribonuclear modificado para nuestra edición de genes. Para minimizar la actividad continua de Cas9 que puede introducir muchas ediciones no deseadas dentro y fuera del objetivo (sistemas tradicionales basados en plásmidos), usamos la proteína Cas9 precomplejada con el crRNA y la plantilla del donante. También utilizamos crRNA sintetizados comercialmente de alta calidad que han sido diseñados para minimizar posibles objetivos no deseados y plantillas de donantes con características para una edición óptima. La aplicación exitosa de este método en una gran cantidad de objetivos utilizando un modelo de células madre sugiere que este método en particular puede ser ampliamente aplicable en muchos loci del genoma humano. La medida en que hemos realizado control de calidad en esta colección de líneas celulares editadas es una característica única adicional de nuestro trabajo.
¿Por qué eligió etiquetar estas 10 estructuras intracelulares particulares?
BR: Nuestro objetivo es producir líneas que marquen la mayoría de las principales estructuras comúnmente estudiadas por los biólogos celulares. Este grupo de 10 estructuras es solo el primer conjunto de esta colección más grande. Las proteínas específicas (genes) se eligieron porque han sido ampliamente utilizadas por la comunidad de biología celular, localizan y delinean la estructura de interés, y se han etiquetado previamente (aunque no siempre de forma endógena) con éxito con GFP.
Está haciendo que estas líneas celulares estén disponibles para su uso. ¿Cómo espera que la comunidad/sociedad científica se beneficie de ellos?
RG: Esperamos que la comunidad científica utilice estas líneas celulares para estudiar diversos aspectos de la biología básica, del desarrollo y de la traducción en un modelo celular diploide y no transformado. Esperamos que los biólogos celulares básicos, más acostumbrados a las líneas celulares transformadas, se lancen a las células madre porque no necesitan producir sus propias líneas celulares, sino que pueden comenzar con esta colección y que estos científicos se beneficien de la biología y la pluripotencia relativamente «normales». de estas células. Esperamos que estas líneas también se utilicen para pantallas genéticas y farmacológicas y modelos de enfermedades mediante la diferenciación en varios tipos de células.
Al etiquetar estas 10 proteínas celulares, ¿cuál es un ejemplo de un desafío que enfrentó y cómo lo superó?
BR: Si bien los desafíos del etiquetado endógeno sistemático de genes humanos en células madre eran relativamente desconocidos al comienzo del proyecto, la eficiencia de HDR, lograr la incorporación precisa de la etiqueta y escalar estos métodos para múltiples genes en paralelo fueron algunos de los desafíos que enfrentamos. enfrentado. Logramos esto mediante el diseño de una estrategia de enriquecimiento FACS (clasificación de células activadas por fluorescencia) para permitir la identificación de ediciones que son tan bajas como 0,05 %, nuevos ensayos basados en PCR para identificar clones editados con precisión, y semiautomatización y multiplexación de ensayos de detección para procesamiento paralelo de aproximadamente 100 clones en nuestro flujo de trabajo de control de calidad y edición de genes.
Hiciste mucho control de calidad. ¿Espera que las líneas clonales se mantengan estables?
RG: Encontramos que los niveles de proteína etiquetada y la pluripotencia permanecen estables con el tiempo, aunque esta prueba se ha limitado a 10-20 pasajes posteriores a la edición. Sin embargo, observamos cierta inestabilidad del genoma en algunas de las líneas clonales tras el paso continuo. Esta es una característica de las líneas de células madre que debe tenerse en cuenta y controlarse, si corresponde al estudio, como parte del cultivo rutinario de células madre.
¿Que vas a hacer despues?
BR: Planeamos expandir nuestra colección y continuar reportando los datos resultantes de esos esfuerzos. También hemos iniciado el etiquetado de genes que no se expresan en las células madre, pero que se activan después de la diferenciación (como los genes cardioespecíficos). Además, planeamos explorar con mucho más detalle el comportamiento dinámico de las estructuras tanto en las células madre como en los cardiomiocitos diferenciados de esta colección de iPSC editadas por genes. También planeamos informar pronto sobre el rendimiento de los modelos de aprendizaje automático que infieren las relaciones entre los orgánulos celulares, que a su vez se basan en una tubería de microscopía de alto rendimiento que está produciendo datos de las líneas celulares en este informe.
¿Algo más que la gente debería saber?
RG: En general, el éxito que hemos tenido en la edición de los 25 genes en los que nos hemos centrado hasta la fecha sugiere fuertemente que el genoma humano, especialmente en las células madre, es susceptible de edición, lo que potencialmente abre muchas posibilidades de edición más emocionantes e importantes para otros genes de interés para los investigadores. Compartimos nuestras estrategias/métodos de edición y detección, las secuencias de crRNA (allencell.org) y los plásmidos donantes (Addgene) para aquellos interesados en etiquetar los mismos genes/proteínas en sus propias líneas celulares.
