La inmunización contra el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2), el organismo que causa la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), normalmente se dirige al dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína espiga, ya que es esencial para el patogénesis del organismo. El RBD está ubicado en la subunidad S1 de la proteína de pico y se une a la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) para permitir la entrada de células virales. En un estudio publicado en Informes científicoslos investigadores han descubierto una nueva forma de inducir inmunidad contra el RBD.
Estudiar: El acoplamiento covalente del dominio de unión del receptor de Spike a un transportador multimérico produce una alta respuesta inmune contra el SARS-CoV-2. Crédito de la imagen: Juan Gaertner/Shutterstock
El estudio
Para obtener un portador multimérico para el RBD, los investigadores decidieron producir una forma oligomérica de Brucella abortus (BLS) en E.coli. Se sintetizó y secuenció un gen que codifica una variante de proteína transportadora de BLS, incluido un sitio de escisión de proteasa TEV N-terminal seguido de una etiqueta Gly. Esto permite que se produzca un polipéptido que porta un Gly-Gly-Gly N-terminal requerido para la reacción de transpeptidación mediada por sortasa A mediante la eliminación del Met N-terminal por digestión con la proteasa TEV.
Una vez que se expresó el BLS en E.coli, se usó cromatografía de intercambio aniónico seguida de cromatografía de exclusión por tamaño para purificar la proteína y se verificó la identidad mediante espectrometría de masas. A continuación, la proteasa TEV podría usarse para generar el motivo Gly-Gly-Gly necesario para funcionar como un sustrato Sortasa A. Se usó P. pastoris para generar el segundo sustrato requerido, que era una variante RBD que incluía una señal de reconocimiento Sortasa A y una etiqueta His en el extremo C-terminal. La estructura terciaria se confirmó usando espectroscopía de CD-UV cercano.
El primer paso en la evaluación de la capacidad del RBD recombinante para actuar como sustrato de sortasa A, una sonda peptídica fluorescente, se utilizó como sustrato en lugar de BLS. Después del acoplamiento y la separación de SEC, alrededor del 17 % del RBD se marcó con la sonda fluorescente. El RBD que no reaccionó todavía estaba etiquetado con la etiqueta His y pudo recuperarse con éxito. La presencia del producto de reacción se reveló con análisis SEC-HPLC, pero no se observó ningún péptido fluorescente libre en el perfil de elución. Esto sugiere que la matriz G25 podría separar el péptido libre restante. En general, los resultados mostraron que es posible realizar el acoplamiento covalente y que la Sortasa A era funcional.
Después de esto, los investigadores evaluaron la funcionalidad del RBD-TMR purificado probando su capacidad para unirse a ACE2. Una mezcla de la proteína marcada, una versión soluble de ACE2 con una etiqueta de His y una resina de agarosa se incubó durante 30 minutos antes de que el complejo ternario de estos se separara por centrifugación. Esto reveló un aumento significativo de la fluorescencia en la fracción soluble, lo que indica que ACE2 ha formado con éxito un complejo con RBD-TMR.
Luego, los científicos intentaron unir los productos RBD y BLS. El análisis SEC-HPLC reveló que el multímero BLS, el RBD solo y el producto de reacción estaban todos presentes al final. Como BLS es una proteína decamérica, los productos eran heterogéneos, por lo que los científicos utilizaron concentraciones bajas de RBD y altas de BLS para obtener multiplicidades más bajas. Se usaron relaciones RBD más altas para obtener multiplicidades más altas.
Para reducir la complejidad del análisis, los glucanos se recortaron con una endoglicosidasa y se resolvieron con SDS page. Cuando se intentó en condiciones por lotes, los investigadores consiguieron obtener rendimientos del 10-20 % del acoplamiento RBD, aumentando hasta el 30 % con la inclusión de un paso de concentración. El producto fue estable durante los ciclos de congelación-descongelación.
Para probar si esto mejoraba la inmunogenicidad del RBD, se inmunizaron ratones con dos dosis con 30 días de diferencia tanto con el RBD desacoplado como con el RBD acoplado a BLS en diferentes multiplicidades. Descubrieron que el RBD acoplado mostró una respuesta significativamente mayor que el desacoplado, lo que apenas afectó la respuesta inmune. La multiplicidad de los multímeros también demostró ser un factor importante, ya que las multiplicidades bajas mostraron respuestas inmunitarias significativamente más bajas en comparación con las multiplicidades más altas.
Finalmente, los investigadores realizaron ensayos de neutralización utilizando lentivirus seudotipados con la proteína de pico SARS-CoV-2. El virus pseudotipado podría entregar el ARN codificado por GFP en las células. Aún así, los sueros inmunes impidieron la transducción de una manera dependiente de la concentración, y los sueros de ratones inmunizados redujeron fuertemente el número de células que expresan GFP.
La conclusión
Los autores destacan que combinaron con éxito el antígeno RBD producido en un eucariota con el portador BLS expresado a partir de E. coli. Además de esto, el ensayo de neutralización de pseudovirus y los resultados de inmunización sugieren que RBD-BLS HM podría ser un candidato muy fuerte para inducir anticuerpos neutralizantes y podría usarse potencialmente en la investigación de vacunas en el futuro.
