Cuando surgió por primera vez la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), los trabajadores de la salud se sintieron frustrados por la falta de tratamientos directos para la enfermedad. Sin ningún medicamento que pudiera atacar directamente el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2), el agente causante de COVID-19, los médicos se vieron obligados a tratar los síntomas con oxígeno suplementario y ventilación mecánica invasiva. Si bien los tratamientos con anticuerpos monoclonales parecían prometedores, sufrieron un revés temprano cuando la FDA canceló uno de los primeros ensayos clínicos debido a la falta de evidencia de eficacia. Ahora, los investigadores han estado investigando el potencial del uso de nanocuerpos, partículas inmunes especiales de llamas y alpacas, contra la enfermedad.
Estudiar: Un potente nanocuerpo derivado de la alpaca que neutraliza las variantes del SARS-CoV-2. Crédito de la imagen: Huen Estructura Bio/Shutterstock
Una versión preliminar del estudio está disponible en la bioRxiv* servidor mientras el artículo se somete a revisión por pares.
Este artículo de noticias fue una revisión de un informe científico preliminar que no se había sometido a una revisión por pares en el momento de la publicación. Desde su publicación inicial, el informe científico ahora ha sido revisado por pares y aceptado para su publicación en una revista científica. Los enlaces a los informes preliminares y revisados por pares están disponibles en la sección Fuentes al final de este artículo. Ver fuentes
El estudio
Los investigadores comenzaron inmunizando a una alpaca con un dominio de unión al receptor de proteína de espiga purificado (RBD). Después de 50 días, los investigadores recolectaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC), a partir de las cuales se generó una biblioteca de genes VHH, y los genes VHH de unión a pico se aislaron mediante exhibición de fagos.
Panorámica frente a la proteína de espiga trimérica de longitud completa purificada para maximizar los epítopos nativos que coinciden con los presentes en el virus vivo. Después de dos rondas de selección, se identificaron aciertos de alta calidad mediante ELISA de alto rendimiento de clones de VHH individuales en RBD inmovilizados. Cualquier éxito que mostró una capacidad de unión significativa se secuenció para determinar los bucles de la región 3 determinante del complemento (CDR3), y las familias de secuencias con un enriquecimiento significativo se analizaron para determinar la actividad neutralizante utilizando lentivirus pseudotipados con la proteína de punta, con GFP como informador.
A partir de estas pruebas, un clon de VHH, conocido como saRBD-1, neutralizó por completo la transducción del pseudovirus y las pruebas posteriores revelaron que el VHH era muy estable y podía unirse bien a la proteína espiga nativa.
En primer lugar, los investigadores determinaron la especificidad de la subunidad del VHH mediante ELISA en la proteína espiga trimérica de longitud completa, las subunidades S1 y S2 y el RBD. Descubrieron que saRBD-1 se unía al RBD con mayor fuerza, con una respuesta de unión máxima (EC50) del 50 % de 607 pM, seguido de la subunidad S1 a 200 pM, la proteína de longitud completa a 100 pM y no se unía a la subunidad S2.
Para comparar la unión de saRBD-1 a RBD con la unión de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2), los científicos realizaron interferometría de biocapa, que mostró un aumento significativo en la unión de saRBD-1 en comparación con ACE2. Para comprobar si el nanocuerpo podía bloquear la interacción ACE2-RBD, se realizaron ensayos de competencia de interferometría de biocapa, que revelaron que una concentración de 6 nM era suficiente para bloquear el 50 % de la unión de ACE2.
Después de esto, los científicos realizaron microscopía de inmunofluorescencia en células Vero E6 que estaban infectadas en presencia del nanocuerpo de control VHH52 o saRBD-1. Descubrieron que saRBD-1 bloqueaba completamente la infección y siguieron esto con ensayos de neutralización de virus, utilizando tanto lentivirus pseudotipados con la proteína de pico SARS-CoV-2 como SARS-CoV-2 vivo.
El nanocuerpo saRBD-1 mostró una concentración de inhibición del 50 % (IC50) de 4,26 nm, mientras que el nanocuerpo de control no mostró inhibición. Contra el virus vivo, se realizaron ensayos de formación de focos que revelaron el título de neutralización de focos del 50 % a 5,82 nm para células Vero E6. Como era de esperar, el control no logró prevenir la infección.
Los investigadores decidieron que, dado que tantas variantes preocupantes portan proteínas de punta significativamente diferentes a las del tipo salvaje, deberían evaluar la afinidad de saRBD-1 por RBD que porta la mutación N501Y y sus capacidades neutralizantes contra aislados de variantes preocupantes.
Después de generar una variante de pico y RBD que contenía N501Y, utilizaron interferometría de biocapa para demostrar que la unión de saRBD-1 a la nueva variante era aproximadamente equivalente a la de tipo salvaje. Con fines de neutralización, los investigadores recolectaron aislamientos de variantes preocupantes con mutaciones conocidas que afectan al RBD. Realizaron ensayos de neutralización, revelando que saRBD-1 muestra una neutralización mejorada nuevamente con la mayoría de las variantes en comparación con el tipo salvaje.
Finalmente, los científicos querían descubrir el epítopo de unión exacto del nanocuerpo, por lo que realizaron ensayos de unión competitiva contra anticuerpos monoclonales. Probaron contra tres clases principales de anticuerpos de unión a RBD, cada uno de los cuales se dirige a epítopos en diferentes ubicaciones. Los anticuerpos de clase 1 tienden a centrarse en epítopos con un pico hacia arriba alrededor de K417, los anticuerpos de clase 2 pueden unirse a ambas conformaciones y tienden a ubicarse alrededor de E484, y los anticuerpos de clase 3 se unen cerca de L452. Sus resultados más sólidos mostraron que saRBD-1 bloqueó la unión del anticuerpo de clase 1 B38, lo que sugiere que saRBD-1 se dirige a un sitio similar.
La conclusión
Los autores identificaron, aislaron y probaron con éxito un nanocuerpo que muestra una capacidad significativa para unirse al SARS-CoV-2 RBD y prevenir infecciones. Si bien aún se necesitan más estudios y ensayos clínicos, esto podría eventualmente convertirse en un medicamento potente y ayudar a los trabajadores de la salud a tratar los casos más graves de COVID-19.
Este artículo de noticias fue una revisión de un informe científico preliminar que no se había sometido a una revisión por pares en el momento de la publicación. Desde su publicación inicial, el informe científico ahora ha sido revisado por pares y aceptado para su publicación en una revista científica. Los enlaces a los informes preliminares y revisados por pares están disponibles en la sección Fuentes al final de este artículo. Ver fuentes
