Una entrevista con el Dr. Bruce R. McCord, realizada por Alina Shrourou, BSc
Se ha anunciado que presentará en el simposio «Métodos analíticos en biología forense y análisis de ADN» en Pittcon 2018. ¿Por qué los métodos bioanalíticos son importantes para la ciencia forense?
El desarrollo de métodos analíticos puede ayudar a los investigadores de hechos, jueces y jurados a comprender mejor los eventos que rodean las circunstancias de un delito. En el análisis forense, estamos hablando de determinar la identidad de personas desconocidas a través del ADN y usar el ADN y otras firmas químicas para determinar y aclarar las circunstancias del crimen.
La ventaja de los métodos analíticos modernos es su especificidad y la capacidad de realizar análisis estadísticos de los datos resultantes. Los ejemplos incluyen el uso de fluorescencia inducida por láser para detectar niveles de trazas de ADN amplificado en la escena del crimen o el uso de análisis espectroscópico para detectar manchas biológicas.
Esta mayor precisión y mayor sensibilidad que permiten los métodos bioanalíticos significa que los científicos forenses pueden ayudar al jurado a llegar a una conclusión válida sobre lo que sucedió.
¿Cuál será el enfoque principal de su charla titulada “Epigenética forense, un método novedoso para la identificación y fenotipado de fluidos corporales”?
Estaré presentando nuestro trabajo sobre la edad y el tipo de tejido. Demostraremos cómo la metilación del ADN epigenético permite la determinación del tipo de líquido corporal, la edad del sospechoso y otra información a partir de los niveles de trazas de las muestras dejadas en las escenas del crimen.
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¿Qué es la metilación epigenética y cómo se puede detectar?
La epigenética implica cambios en la función de los genes que no están relacionados con cambios en la secuencia de ADN. Es bien sabido que todo el ADN humano es el mismo y está compuesto por las mismas bases de nucleótidos. Sin embargo, es fácil ver que las células se diferencian según su aplicación: piel, músculo, hueso, etc. Estas diferencias son el resultado de cambios moleculares que determinan la expresión génica.
Uno de esos cambios implica la metilación diferencial de la citosina, una de las cuatro bases principales que se encuentran en el ADN. Es común encontrar ubicaciones aguas arriba de varios genes conocidos como islas CpG (una base de citosina seguida inmediatamente por una guanina) en las que se producen grupos de citosinas metiladas. Cuando el nivel de metilación de un tejido específico es diagnóstico, el procedimiento se puede utilizar para determinar el tipo de célula. De manera similar, otras ubicaciones en el genoma pueden indicar la edad de un sospechoso.
La presencia de metilación en estos lugares se puede detectar de varias formas. Un método común es usar PCR modificada con bisulfito. Este proceso convierte químicamente los pares de bases GC no metilados en pares de bases AT mediante modificación química y amplificación por PCR.
Las citosinas metiladas no se convierten. El resultado de este proceso se lee fácilmente utilizando métodos de secuenciación de ADN.
Resuma los métodos de secuenciación involucrados en la localización de loci epigenéticos.
Utilizamos principalmente 3 métodos para leer el ADN y determinar si la metilación está presente en loci específicos. En primer lugar, los datos de matriz de metilación nos ayudan a determinar los sitios potenciales de interés en todo el genoma humano.
Luego examinamos y calificamos estos datos y buscamos CpG específicos en los datos de la matriz que pueden indicar la presencia de secuencias de interés. Diseñamos cebadores específicos para identificar regiones de interés en el genoma y usamos pirosecuenciación para determinar si estas ubicaciones son probatorias. Estas ubicaciones luego se prueban mediante PCR modificada con bisulfito y pirosecuenciación.
Por último, debido a la diferencia en la temperatura de fusión entre los pares de bases GC y AT, también podemos apuntar a ubicaciones mediante PCR en tiempo real con capacidad de fusión de alta resolución, siempre que existan grandes diferencias en la metilación.
¿Cómo se puede utilizar la metilación epigenética en la escena del crimen?
Utilizamos este procedimiento para determinar los niveles de trazas de fluidos corporales. Esto puede ser particularmente importante en situaciones que involucran delitos como agresión sexual o abuso infantil, donde el sospechoso está presente y encontrar su ADN no sería inesperado.
Sin embargo, el tipo de ADN recuperado, ya sea de un fluido corporal, en comparación con las células de la piel, por ejemplo, podría indicar si realmente ocurrió un crimen. De manera similar, si se identifica un número de sospechosos, la determinación de la edad de una muestra desconocida de la escena del crimen sería muy importante.
¿Cómo pueden los loci CpG identificar las elecciones de estilo de vida de un individuo y cuán válidas son estas suposiciones?
Las opciones de estilo de vida, como fumar, pueden alterar el nivel de metilación en ciertos CpG. En muchos casos, al igual que la epigenética específica de tejido, estos loci están vinculados a genes específicos que se activan por la necesidad del cuerpo de mediar en el efecto del estilo de vida. La validez solo se puede determinar mediante la determinación de la función del gen y los experimentos con muestras de población, pero esta es un área importante de investigación en muchos campos biomédicos.
Apenas estamos comenzando a examinar esta área, pero notamos que existen investigaciones anteriores que determinan los vínculos entre los marcadores epigenéticos y factores como el tabaquismo.
¿Qué datos presentará durante su charla y cómo se compara esto con otras investigaciones en el campo?
Si bien toda la investigación forense se ocupa de la identidad humana, el fenotipado y el uso para evaluar la información biológica dejada por los sospechosos en la escena del crimen, nuestro enfoque es diferente de la mayoría de las demás investigaciones en el campo, ya que nos enfocamos en marcadores de interés en la ciencia forense. Otros en este campo están más preocupados por las aplicaciones biomédicas.
Como los loci epigenéticos se originan en el ADN, podemos usar el poder de estar en la raíz del árbol de expresión génica. Al realizar la modificación con bisulfito antes de la amplificación, tenemos una ventaja en lo que respecta al fenotipado del ADN, ya que esto significa que nuestro proceso es resistente a la inhibición y a los factores que pueden intervenir en la expresión génica. Otros métodos que usan ARN o proteómica, como se usa en la investigación forense tradicional, pueden estar sujetos a variaciones en la expresión génica que requieren corrección.
Por lo tanto, imaginamos que una parte de la muestra de ADN forense se puede desviar para determinar la edad y el tejido.
¿Existen otras ventajas de usar loci epigenéticos en la identificación de fluidos corporales sobre otros métodos?
Es importante para nosotros asegurarnos de que nuestras interfaces funcionen bien con las técnicas forenses tradicionales, para que se implementen más fácilmente en un laboratorio. Por lo tanto, quizás la mayor ventaja del análisis epigenético es que la extracción de la muestra y la recuperación del ADN son las mismas que con la tipificación de ADN estándar y la epigenética forense.
Además, dado que la metilación implica enlaces covalentes, este método es extremadamente estable: ¡las muestras de más de 20 años se pueden analizar de esta manera!
¿Dónde ve usted el desarrollo de la epigenética en la biología forense?
Veo el desarrollo de la epigenética como una herramienta para complementar la tipificación de ADN forense estándar, y es probable que nuestro trabajo contribuya a este desarrollo. Creo que los métodos futuros que involucran secuenciación paralela masiva (MPS), también conocida como secuenciación de próxima generación (NGS), incluirán procedimientos para análisis epigenético y genotipado simultáneos.
En cuanto a avanzar en el campo, es demasiado pronto para saberlo. Sin embargo, creemos que la epigenética puede ser una herramienta importante en la serología de trazas y en las investigaciones forenses de individuos que aún no están en una base de datos debido a su capacidad para detectar la edad y cierta información fenotípica.
¿Dónde pueden los lectores encontrar más información?
El documento relacionado con nuestra investigación se puede encontrar aquí:
Madi, T., Balamurugan, K., Bombardi, R., Duncan, G. y McCord, B. (2012). La determinación de patrones de metilación de ADN específicos de tejido en biofluidos forenses mediante modificación con bisulfito y pirosecuenciación. electroforesis, 33: 1736-1745.
Me gustaría agradecer a los estudiantes y colaboradores que trabajaron en el proyecto citado, incluidos Tania Madi, Joana Antunes, Debora Silva, Hussain Alghanim (FIU) Kuppareddi Balamurugan (U. Southern Mississippi) George Duncan (Broward Sheriff’s Office) y Clarice Alho ( Pontificia Universidad Católica de Rio Grande Do Sul, Brasil). También me gustaría agradecer al Instituto Nacional de Justicia por proporcionar los fondos para el trabajo, así como la asistencia técnica de Qaigen.
También hay una serie de otros documentos que puede consultar para obtener más información:
- Alghanim, H., Antunes, J., Silva, DSBS, Alho, CS, Balamurugan, K. y McCord, B. (2017). Detección y evaluación de marcadores de metilación del ADN encontrados en los loci SCGN y KLF14 para estimar la edad humana. Forensic Science International: Genética, 31: 81-88.
- Antunes, J., Silva, DS, Balamurugan, K., Duncan, G., Alho, CS y McCord, B. (2016). Discriminación forense de epitelios vaginales mediante análisis de metilación de ADN mediante pirosecuenciación. electroforesis, 37: 2751-2758.
- Silva, DS, Antunes, J., Balamurugan, K., Duncan, G., Alho, CS y McCord, B. (2016). Estudios de validación del desarrollo de marcadores epigenéticos de metilación del ADN para la detección de muestras de sangre, semen y saliva. Forensic Science International: Genética, 23: 55-63.
- Antunes, J., Silva, DS, Balamurugan, K., Duncan, G., Alho, CS y McCord, B. (2016). Análisis de fusión de alta resolución de la metilación del ADN para discriminar semen en tinciones biológicas. Bioquímica analítica, 494: 40-45.
- Soares Bispo Santos Silva, D., Antunes, J., Balamurugan, K., Duncan, G., Sampaio Alho, C., & McCord, B. (2015). Evaluación de marcadores de metilación del ADN y su potencial para predecir el envejecimiento humano. Electroforesis, 36: 1775-1780.
Acerca del Dr. Bruce McCord
Bruce R. McCord es actualmente profesor de química analítica y forense en la Universidad Internacional de Florida. Recibió una licenciatura en Química con honores de la Universidad de William and Mary y su doctorado en Química Analítica de la Universidad de Wisconsin-Madison.
Sus intereses de investigación actuales involucran el desarrollo de aplicaciones en genómica forense, epigenética, microfluídica y detección a nanoescala. Las principales áreas de investigación incluyen el desarrollo de técnicas mejoradas para el análisis genético utilizando electroforesis capilar y microfluídica, secuenciación de ADN y QPCR.
También tiene esfuerzos de investigación en aplicaciones toxicológicas de espectrometría de masas, espectroscopia Raman mejorada de superficie y microfluidos.
Actualmente se desempeña como editor adjunto de la revista Electrophoresis y es miembro de los consejos editoriales de Journal of Forensic Science y Journal of Forensic Chemistry. Ha publicado más de 100 artículos revisados por pares y 12 capítulos de libros y ha graduado a 20 estudiantes de doctorado, 15 estudiantes de maestría y supervisó a 12 investigadores postdoctorales. En 2008 recibió el Premio Paul Kirk de la AAFS por sus contribuciones al campo de la criminalística.
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