Entrevista realizada con el Dr. Bob St. Onge
¿Puede proporcionar una descripción general de su trabajo/su investigación en SGTC?
El SGTC está ampliamente interesado en desarrollar nuevas tecnologías para la biología y la investigación médica que, en última instancia, mejoren y reduzcan el costo de la atención médica.
Mi investigación utiliza la levadura en ciernes como herramienta para la biología sintética, y también en aplicaciones genómicas químicas y funcionales. Estamos más interesados en desarrollar métodos que aborden problemas difíciles que las tecnologías existentes no solucionan fácilmente.
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¿Puede compartir más sobre la investigación/experimentos/ensayos mismos? ¿Hay algún ensayo posterior en el que se incluya, por ejemplo, extracción de ADNc, identificación a través de oligo o NGS?
Los ensayos que realizamos generalmente involucran la medición de miles de cepas de levadura en paralelo, cada una con una composición genética diferente. Por lo general, estamos midiendo la tasa de crecimiento o la aptitud de estas cepas durante el crecimiento competitivo en un solo cultivo.
Usamos códigos de barras de ADN únicos para identificar cada cepa y, luego del crecimiento en una condición de interés, estos códigos de barras se extraen de la levadura y luego se cuantifican.
En los primeros días de este enfoque, usábamos micromatrices de ADN para medir la abundancia de códigos de barras individuales, pero hoy en día usamos la secuenciación de próxima generación.
¿Qué impacto proporcionará su investigación y cuáles serán las implicaciones para nuevos estudios en el futuro?
Un impacto es la generación de información funcional cuantitativa para el genoma. Podemos aprender mucho sobre lo que hace un gen al identificar las condiciones bajo las cuales ese gen es esencial para la viabilidad del organismo.
En el pasado, estos experimentos involucraban la eliminación de genes, es decir, cepas en las que se eliminaba un gen completo. Sin embargo, más recientemente, estamos utilizando tecnologías de edición de genes como CRISPR/Cas9, para generar cambios genéticos más pequeños y precisos, por ejemplo, aquellos que dan como resultado un cambio de un solo aminoácido, y medir el efecto de esos.
Estos tipos de cambios genéticos son mucho más comunes en la naturaleza, y la comprensión de estos vínculos genotipo-fenotipo en la levadura eventualmente conducirá a una mejor comprensión de estos vínculos en las personas.
También utilizamos estos ensayos para comprender el mecanismo de los fármacos y otras moléculas pequeñas bioactivas. Las mutaciones que afectan la abundancia de la proteína diana de un fármaco a menudo alterarán la respuesta de la célula a ese fármaco.
Por lo tanto, al cuantificar sistemáticamente la aptitud de miles de cepas en presencia de un fármaco, podemos identificar posibles objetivos farmacológicos de manera imparcial. En el pasado, estos experimentos usaban bibliotecas químicas comerciales, pero más recientemente hemos podido diseñar levaduras para producir nuestros propios compuestos, al expresar las vías de productos naturales de otros hongos.
Las levaduras tienen ciertos atributos que las convierten en un excelente anfitrión para ensamblar estas vías a partir de ADN sintético. La implementación de nuestros ensayos genómicos para comprender las actividades de cualquier compuesto producido por estas vías es sencilla.
¿Puede describir su proceso automatizado del flujo de trabajo en sí?
Esencialmente, nuestro proceso implica producir grandes colecciones de cepas, cultivar estas cepas de manera competitiva en diferentes condiciones y luego cuantificar la aptitud de cada cepa en cada condición. La fase de crecimiento competitivo es una parte clave del proceso.
La levadura crece muy rápido, duplicándose cada 90 minutos más o menos, y recolectar múltiples muestras de cultivos que pueden estar creciendo a diferentes velocidades es prácticamente imposible sin un sistema automatizado. Estas muestras deben almacenarse adecuadamente hasta que puedan procesarse más.
¿Puede proporcionar algunos detalles sobre el sistema automatizado que utiliza, tanto de hardware como de software?
El sistema que estamos usando se modeló a partir de un sistema diseñado en el SGTC por mi colega, el Dr. Michael Proctor. El hardware consta de un manipulador de líquidos Tecan Freedom EVO, 4 lectores de placas Tecan Infinite y 4 enfriadores de placas controlados por un software personalizado.
Básicamente, la levadura se cultiva en placas de microtitulación en los lectores Infinite con agitación ya una temperatura constante, y el crecimiento se controla continuamente tomando medidas de densidad óptica cada 15 minutos.
El sistema realizará automáticamente tareas de pipeteo cuando se alcance una OD de ‘activación’; por ejemplo, guardar una alícuota del cultivo en un enfriador de placas, agregar un reactivo al cultivo desde la plataforma o diluir el cultivo para mantener el crecimiento en fase logarítmica durante varias generaciones. El usuario define estas tareas en el software antes de iniciar el experimento.
¿Cuáles son los beneficios que brinda el sistema automatizado y qué barreras les ha ayudado a superar?
Hay varios beneficios. Por un lado, realizar los experimentos en placas de microtitulación, a diferencia de los matraces, nos permite procesar muchas más muestras y minimizar el uso de reactivos. Además, la recolección de muestras en un punto fijo de crecimiento de muchos cultivos diferentes solo se puede hacer de manera realista con un sistema automatizado como este.
Esto realmente mejora la reproducibilidad del ensayo. Finalmente, las mediciones de OD recopiladas brindan una vista detallada de la cinética de crecimiento de nuestro cultivo combinado, que a menudo es útil para interpretar los resultados de la cuantificación del código de barras de ADN.
¿Qué tan satisfecho está con el desempeño del sistema? ¿Por qué Tecan EVO?
Estamos muy satisfechos principalmente porque el sistema ejecuta de manera confiable los protocolos que usamos con más frecuencia. Nuestro trabajo anterior identificó algunas características de diseño clave, tanto relacionadas con el hardware como con el software, que pudimos adoptar en el sistema actual con la ayuda de Tecan. Creo que eso ayudó mucho.
¿Hay otros usos/estudios para los que se ha adoptado el sistema? ¿Cuales son tus planes para el futuro?
Estamos generando muchas colecciones de cepas nuevas y planeamos usar el sistema para perfilarlas bajo diferentes condiciones de crecimiento. También estamos generando nuevos compuestos químicos que, con suerte, exhibirán nuevas actividades biológicas interesantes. El sistema se utilizará aquí también.
¿Dónde pueden los lectores encontrar más información?
Hemos publicado algunos artículos recientemente en los que se utilizó el sistema. (PMID: 26956608, 28193641, 28541284)
Acerca del Dr. Bob St. Onge
Bob St.Onge es un científico investigador sénior en el Centro de Tecnología del Genoma de Stanford que desarrolla nuevos métodos genómicos y de biología sintética en la levadura en ciernes S. cerevisiae.
Estos métodos se utilizan para comprender mejor las relaciones genotipo-fenotipo, definir el mecanismo de acción de los compuestos bioactivos y optimizar la expresión heteróloga de grupos de genes de productos naturales en la levadura.
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